Marcadores de ADN

Los marcadores de ADN constituyen la nueva generación de marcadores moleculares y solucionaron el problema de la carencia de marcadores que tenían las isoenzimas, pues son capaces de generar una cantidad virtualmente infinita de marcadores. Existen varias técnicas para identificar marcadores de ADN, las que se pueden agrupar en tres categorías: las de hibridación tipo Southern, las de reacción de polimerización en cadena (PCR) y las que combinan PCR o sus productos de ADN con la hibridación tipo Southern.

La hibridación consiste en la formación de una molécula de doble cadena mediante el apareamiento o unión de bases complementarias de dos moléculas de una sola cadena. La hibridación tipo Southern explora las variaciones en la longitud o tamaño de los fragmentos de ADN ocasionadas por la restricción del genoma mediada por una enzima particular (endonucleasa). Esta técnica comprende las siguientes etapas: primero se extrae el ADN del material que deseamos estudiar; luego se le adicionan enzimas de restricción (endonucleasas), las cuales cortan el ADN en fragmentos de diferente longitud; estos fragmentos son separados en geles de agarosa, para después realizar por capilaridad o al vacío la transferencia de los fragmentos a una membrana de papel de nitrocelulosa o de nylon (transferencia tipo Southern). Finalmente, se hibridizan los fragmentos de la membrana con sondas marcadas (radiactiva o no radiactivamente) para visualizar y detectar las bandas hibridadas.

Dentro de esta técnica se encuentran los marcadores RFLP (polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restricción) y los VNTR (secuencias adyacentes que se repi ten en número variable). 

La técnica de PCR, o reacción en cadena de la polimerasa, es una tecnología utilizada para multiplicar (sintetizar) in vitro fragmentos específicos de ADN con la finalidad de detectar una secuencia o gen de interés en el genoma del individuo en estudio. Se basa en la amplificación de fragmentos de ADN a partir de secuencias de nucleótidos denominadas “cebador” (primer), que son capaces de reconocer una secuencia blanco para la cual es complementaria.
En forma general, los principales pasos del PCR son los siguientes: se extrae el ADN del material a analizar, se separa la molécula del ADN en dos hebras (desnaturalización), se induce el alineamiento o reconocimiento del cebador con las secuencias blanco complementarias o molde del ADN, y por medio de la enzima Taq polimerasa se lleva a cabo la extensión o alargamiento de la molécula iniciadora (cebador). Este proceso se realiza en un termociclador, que se encarga de realizar los cambios de temperatura necesarios para que se desarrollen las etapas o ciclos anteriormente mencionados. Los ciclos se repiten la cantidad de veces que sea necesario, hasta obtener la cantidad de copias de ADN que se requieran.

Dentro de esta metodología se encuentran los marcadores llamados RAPD (ADN polimórfico amplificado al azar), PCR iniciada con microsatélites (MP-PCR), AFLP (polimorfismo de longitud de fragmentos amplificados) y DAF (amplificación de huellas del ADN), entre otros.

Finalmente, dentro de las metodologías que combinan la PCR o sus productos de ADN más la hibridación tipo Southern, están los RAHM y RAMPO (amplificación aleatoria del polimorfismo de microsatélites).

Ventajas y aplicaciones de los marcadores de ADN

Son muy ventajosos los marcadores de ADN ya que no son afectados por el ambiente, están presentes en cualquier estadio del individuo, permiten una detección temprana, son universales, muy abundantes, se requiere poca cantidad de ADN para los análisis y el ADN es muy estable y específico para cada individuo (huella génica). Sin embargo, son relativamente costosos, necesitan personal entrenado, equipos sofisticados y un estricto control de la contaminación.

El uso de marcadores moleculares en los análisis genéticos y en el mejoramiento de las plantas ha tenido una difusión extremadamente rápida. Las principales aplicaciones incluyen la obtención de “huellas genéticas” (fingerprinting) genómicas de individuos, variedades y poblaciones; el análisis de la estructura y diversidad genética en poblaciones naturales y de mejoramiento y bancos de germoplasma; el establecimiento de relaciones filogenéticas entre diferentes individuos y especies; la construcción de mapas genéticos de alta cobertura genómica y la localización de genes de interés económico, mapeo de características de herencia cuantitativa QTL (Quantitative Trait Loci ) y selección MAS auxiliada por marcadores (Marker Asisted Selection).